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Catalog No. B-P-00002-2、B-P-00002-4、B-P-00002-10

Specification 2ml-kit、4ml-kit 、10ml-kit

Storage 4℃保存、 保存兩年

3D細(xì)胞球體培養(yǎng)試驗(yàn)步驟：

A、試劑制備

1、A基質(zhì)膠：將A基質(zhì)膠溶于37℃水浴槽回溫10分鐘， 確認(rèn)*融解.

2、C緩沖溶液(1X)制備：使用前將10X C緩沖溶液用冰的無細(xì)胞培養(yǎng)液(例如： 無血清DMEM、opt-MEM) 制備成 1X C 緩沖溶液。(不要用 PBS 稀釋 C 緩沖液) .

3、D 緩沖溶液(1X)制備: 使用前用冷的 1x PBS 稀釋 10X D 緩沖溶液至 1X D 緩沖溶液.

B、Biozellen®3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠的制備

全部步驟需要在無菌環(huán)境內(nèi)操作，操作步驟如下：

1、將24孔培養(yǎng)板放置于冰上預(yù)冷半小時(shí)。

2、細(xì)胞計(jì)數(shù)后取 2×105~2×107 細(xì)胞與 0.5 毫升 37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)基均勻混合，并與0.5毫升37℃ A膠按照 1:1 等比例均勻混合，最終細(xì)胞密度1*105~1*107cells/mL。

注：請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溶液與條件進(jìn)行試驗(yàn)。

3、取 20-40 微升步驟 2的混合液滴于 步驟 1 預(yù)冷的培養(yǎng)板上，膠體將于 5 分鐘內(nèi)成膠。 注: 測(cè)試膠體是否成膠，可用微量吸管尖溫和的觸碰膠體表面進(jìn)行確認(rèn)。

4、待膠體成膠后，添加1毫升冰的1X C緩沖溶液，并蓋過步驟3 的膠溶液，固定 15 分鐘。

5、待15分鐘固定后，小心的吸取 C 緩沖溶液并置換為適合此細(xì)胞生長(zhǎng)之培養(yǎng)基溶液。

6、將含有細(xì)胞的膠于37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行7~14天的培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞球體的形成，按正常培養(yǎng)基更換頻率進(jìn)行更換操作。

C、溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序

1、小心的將培養(yǎng)基吸取移除，并用1X PBS進(jìn)行清洗。

2、小心的將 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的D緩沖溶液，蓋過膠滴于室溫反應(yīng) 5分鐘。

3、溫和的用1毫升移液管吸取，直到膠滴*溶解。

4、將含有細(xì)胞球體的溶液吸入1.5 毫升離心管，用1000 rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，移除上清液體并收集細(xì)胞球體做分析。

D、收集單顆細(xì)胞準(zhǔn)備程序

在分離單細(xì)胞前，先按上述溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序進(jìn)行操作

1、添加trypsin-EDTA并與收集的細(xì)胞球體于37°C混合反應(yīng)。

2、用1毫升移液管混合，直到細(xì)胞體*分解。

3、待細(xì)胞球體*分解，加入3倍體積的1X PBS，并用1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心10分鐘，并移除上清液體收集沉淀的單細(xì)胞做分析。